Rev. Colombiana cienc. Anim. 3(2).2011 NOTA CORTA
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DETERMINACIÓN DE LA GENOTOXICIDAD DE LA IVERMECTINA A TRAVÉS
DEL ENSAYO COMETA
DETERMINATION OF THE GENOTOXICITY OF THE IVERMECTINA THROUGH OF THE
COMET ASSAY
MONTES, V. DONICER
1
Esp., MONTERO, P. YINA
2
Biól ., MORENOROOSI, ALBERTO
3
M.Sc., GONZÁLEZ , HENRY
3
Esp.
1
Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento
de Zootecnia, Sincelejo, Colombia, Grupo Reproducción y Mejoramiento
Genético Animal
2
Universidad de Sucre, Grupo Investigaciones Biomédicas
3
Universidad del Atlántico, Facultad de Ciencias Básicas, Grupo de
Investigaciones Genética y Bioquímica.
Correspondencia:* donicer.montes@unisucre.edu.co
Recibido: 16-06-2011; Aceptado: 16-09-2011
En las últimas décadas se han desarrollado diversos antihelmínticos de gran
efectividad frente a diferentes tipos de parásitos, los cuales amplían las alternativas
de tratamiento, con el objeto de evitar el desarrollo de resistencia de los parásitos a
la acción del fármaco. En la década del 80 y a principio de los 90, se introdujeron
nuevos antihelmintos de amplio espectro que pertenecen a las familias de las
Avermectinas y Milbemicinas, en éstas se incluyen compuestos naturales y
semisintéticos que tienen similar estructura, un modo de acción común y semejante
espectro de actividad, pero difieren en sus propiedades farmacocinéticas que
determina que la actividad de las milbemicinas (moxidectina) sea más persistente y
presenten una mayor eficacia sobre los artrópodos. Uno de estos compuestos es
la Ivermectina (IVM), antiparasitario endectócido, utilizado ampliamente en el
control de nematodos y artrópodos que afectan a los bovinos. Su prolongada
permanencia en el plasma y su lipofilicidad aseguran la efectividad farmacológica
(IGLESIAS et al., 2005). La IVM es el resultado de la fermentación bacteriana del
Streptomyces avermitilis, obtenido por primera vez en el año 1979, es un fármaco
muy liposoluble y poco hidrosoluble, por lo que se puede aplicar por todas las vías,
siendo las más recomendadas la subcutánea (SC), intramuscular (IM) y tópica
“pour-on”. Es un análogo semisintético de la abamectina, conteniendo un 80% de
dihidroavermectina B1a y no más de un 20% dedihidroavermectinaB1b (LIFSCHITZ
et al., 2002). La IVM es la Lactona Macrociclica (LM) de mayor difusión y utilización
en las diferentes especies de animales en todo el mundo; por lo tanto, es la
molécula que más se ha estudiado con respecto a sus características fármaco-Rev. Colombiana cienc. Anim. 3(2).2011 NOTA CORTA
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dinámicas y farmacocinéticas. Las propiedades físico químicas de la IVM incluyen
un alto peso molecular y una elevada lipofilicidad, las que le confieren
características fármaco cinéticas de un alto volumen de distribución, con una gran
afinidad por la grasa corporal y prolongada persistencia de sus concentraciones en
el organismo (OMURA , 2008).
La IVM se excreta en altas concentraciones en la bilis de bovinos. Mediante el ciclo
entero hepático el fármaco es receptado hacia la sangre para luego pasar al
intestino obteniéndose altas concentraciones del fármaco en duodeno e íleon
(HENNESSY et al., 2000). En la mucosa abomasal, las concentraciones de IVM
encontradas posterior a la administración de una dosis subcutánea de 0,2 mg/kg
son levemente menores a las encontradas en la mucosa del intestino delgado.
Otros estudios realizados en ratas han demostrado que hay una excreción directa
de IVM hacia el intestino eliminándose cantidades de fármaco activa en el lumen
intestinal y heces (LAFFONT et al., 2002). Efectos letales y subletales por acción
de la droga sobre organismos coprófilos no perjudiciales para los bovinos fueron
informados por WARDHAUGH et al. (2001). No obstante, un aspecto poco
considerado en los estudios es el nivel de daño que esta droga, puede causar en
las estructuras del ADN. En lo que respecta a estudios tendientes a caracterizar la
citotoxicidad de la IVM, sólo ha sido reportado, hasta el presente, datos
provenientes de un estudio in vitro realizado en células CHO, estimando la
capacidad de proliferación celular en un medio de cultivo suplementado con un
suero sustituto en presencia de diferentes dosis de la droga (RODRÍGUEZ y
MATTEI, 1987). Sin embargo, se han realizado análisis mediante diversos ensayos
in vitro de genotóxicidad (frecuencia de ICHs y ensayo cometa) y citotoxicidad
(progresión de ciclo celular, índice mitótico, ensayos de MTT y rojo neutro), para la
capacidad deletérea tanto de la IVM como una de sus formulaciones comerciales
Ivomec® (IVM 1%, Merial Argentina S.A.). Los resultados han puesto en evidencia
que ambos compuestos ejercen un efecto genotóxico y citotóxico en células CHOK1 cuando las mismas son expuestas a concentraciones equimolares del principio
activo de 1,0-250,0 µg/ml (MOLINARI et al., 2008 ).
El tiempo de liberación de la IVM es de sólo siete días después del tratamiento
subcutáneo en bovinos. En un estudio se encontró que la IVM al 3,15% (0,63
mg/kg pv) inoculada a bovinos permanece en concentraciones plasmáticas > 2
ng/ml a los 50 días post tratamiento (LIFSCHITZ et al., 2007). Los parámetros
farmacocinéticos promedios de la IVM obtenidos en plasma después de ser
administrados por vía SC a razón de 0,2 mg/kg pv en bovinos se presentan en la
Tabla 1.Rev. Colombiana cienc. Anim. 3(2).2011 NOTA CORTA
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Tabla 1. Valores fármaco cinéticos obtenidos para la IVM (RODRÍGUEZ et al., 2010)
Parámetros cinéticos Ivermectina
T_ab(días) 39,20
C max (ng/mL) 42,80
T_ max (días) 4,00
ABC total (ng.d/Ml 459,00
TMR(días) 7,35
Vdss/F(L/kg) 3,35
ClB/F(mL/d/kg) 457,00
T_ab: Tiempo medio de absorción;Cmax: Máxima concentración plasmática,Tmax: Tiempo en que
se alcanza la Cmax ,ABCtotal: área bajo la curva de concentración frente a tiempo extrapolada al
infinito ;TMR: Tiempo medio de residencia; Vdss/F: Volumen de distribución en el estado
estacionario; ClB/F: Aclaramiento corporal total ;Vdss y Cl representan sus verdaderos valores en
relación a la fracción absorbida del fármaco.
Se tiene poco conocimiento sobre el posible potencial genotóxico y/o citotóxico de
la IVM, ya sea sobre el organismo vector (invertebrado), mamíferos e incluso el ser
humano, en los cuales el compuesto es empleado para prevenir las variadas
parasitosis (STURCHIO, 2001; RODRÍGUEZ et al., 2006). Sin embargo, existe
amplia información de estudios realizados in vivo destinados a evaluar la forma de
administración, las diferentes dosis terapéuticas dependiendo del parásito en
cuestión y del vertebrado hospedador (LIFSCHITZ et al., 2007), la sensibilidad del
invertebrado a la droga (INTAPAN et al., 2006) y las posibles resistencias de estos
últimos a la misma (KANE et al., 2000; FIEL et al., 2001).
Por lo expuesto anteriormente, las agencias internacionales reguladoras de su
empleo terapéutico no han evaluado, o al menos definido, el potencial mutagénico,
carcinogénico y/o teratogénico de la IVM ya sea en lo que respecta al hombre
como a cualquier otra especie animal expuesta a la misma, por lo que se hace
necesario la evaluación del daño genético (ADN) causado por la IVM. Teniendo
en cuenta el uso masivo que los ganaderos en Colombia hacen de la IVM, en
todas sus presentaciones comerciales, se realizó monitoreo de 2 vacas tratadas
con IVM al 3,15%, para el control de garrapatas (Arthropoda, Acari), en la Granja
experimental de La Facultad de Ciencias Agropecuaria de la Universidad de Sucre,
con el objeto de evaluar el daño genético (ADN) causado por la IVM, las dosis
utilizadas fueron las estipuladas por la casa comercial que distribuye el producto
(1cc/50 Kg de pv-vía SC). La extracción de la muestra sanguínea fue realizada a
los 14 días pos tratamiento, mediante punción venosa con aguja para vacutainer
(caudal medial), se extrajeron 4 ml de sangre entera (vacutainer con EDTA como Rev. Colombiana cienc. Anim. 3(2).2011 NOTA CORTA
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anticoagulante), las cuales fueron etiquetados y conservadas en frío de acuerdo al
protocolo de traslado al laboratorio para su procesamiento.
El procesamiento de la muestra se realizó en el laboratorio de la Universidad de
Sucre, a través de la técnica del ensayo cometa o electroforesis de una célula, de
acuerdo a lo planteado por DHAWAN et al. (2005).
La visualización de las placas se realizó en el laboratorio de Biología Molecular
de la Universidad Simón Bolívar, a través de microscopio fluorescente. Para
evaluar el daño al DNA se observaron 100 células por cada placa.
La Prueba cometa, permite la detección de daño simple y doble cadena de ADN,
este ensayo es potencialmente sensible para evidenciar daño genotóxico inducido
(MUDRY y CARBALLO, 2006), su nombre deriva de la apariencia que cobran las
células tras la realización del ensayo: una cabeza intensamente brillante, y una cola
cuya longitud e intensidad están relacionadas con la cantidad de roturas de cadena
del ADN que contiene. En contraste, las células no dañadas presentan aspecto de
núcleos intactos, sin cola. Esto es debido a la migración de los fragmentos de ADN
dañado hacia el ánodo, al ser sometida la célula a una diferencia de potencial
durante una electroforesis (LAFFON et al., 2004).
Como se puede observan en la Fig. 1, mediante el ensayo cometa fue factible
evidenciar que la concentración de IVM al 3,15%, fue capaz de inducir rupturas
de cadena simple en la molécula de ADN. GONZALEZ et al. (2008) analizaron
mediante diversos ensayos in vitro de genotóxicidad (frecuencia de ICHs y ensayo
cometa) y citotoxicidad (progresión de ciclo celular, índice mitótico, ensayos de
MTT y rojo neutro), la capacidad deletérea tanto de la IVM como una de sus
formulaciones comerciales Ivomec® (IVM 1%, Merial Argentina S.A.). Los
resultados evidenciaron que ambos compuestos ejercen un efecto genotóxico y
citotóxico en célulasCHO-K1 cuando las mismas son expuestas a concentraciones
equimolares del principio activo de 1,0-25,0 µg/ml (MOLINARI et al., 2008). Los
resultados mostraron que ambos compuestos, independientemente del ensayo
empleado, manifestaron una gran capacidad citotóxica a partir de la concentración
de 10,0 µg/ml incorporada al sistema de cultivo. De esta forma, la concentración de
10,0 y 25,0 µg/ml de IVM así como únicamente 25,0 µg/ml de Ivomec® indujeron
un alargamiento del ciclo celular. Por lo antes expuesto, se puede aseverar que el
antiparasitario IVM al 3,15% ejerce efectos deletéreos sobre el metabolismo
celular y la maquinaria genética de las células tratadas.Rev. Colombiana cienc. Anim. 3(2).2011 NOTA CORTA
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A
B
C
D
Figura 1. A,B,C,D . Células con daños en el ADN, detectado a través del ensayo cometa.
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